Kluczowe kwestie projektowe dotyczące protokołów badania walidacji klirensu wirusa w produktach terapii genowej

ICH Q5A(R2)-Międzynarodowa Fundacja Harmonizacji

ICH Q5A(R2) został oficjalnie przyjęty 1 listopada 2023 r. i stanowi podstawowy międzynarodowy dokument zawierający wytyczne dotyczące oceny bezpieczeństwa wirusowego. W porównaniu z Q5A(R1) opublikowanym w 1999 r., istotne aktualizacje wersji R2 obejmują: nowo dodany rozdział dotyczący oceny bezpieczeństwa wirusowego w produkcji ciągłej (rozdział 7); wzmocniona rola oceny ryzyka jako podstawy strategii usuwania wirusów; włączenie sekwencjonowania-następnej generacji (NGS) do zagadnień związanych z wykrywaniem wirusów; oraz wyraźne wymagania dotyczące oceny nowatorskich produktów i procesów produkcyjnych. Q5A(R2) został przyjęty przez organy regulacyjne, w tym FDA, EMA i PMDA, zapewniając ujednolicone ramy techniczne dla walidacji usuwania wirusów na całym świecie.

NMPA-Chiński system regulacyjny

Ramy regulacyjne NMPA dotyczące bezpieczeństwa wirusowego obejmują wiele poziomów:

Poziom dokumentu	Nazwa dokumentu	Rok wydania
Dokument założycielski	Wytyczne techniczne dotyczące usuwania/inaktywacji wirusów z produktów krwiopochodnych	2002
Dokument założycielski	Ogólne zasady przeglądu technicznego oceny bezpieczeństwa wirusologicznego tkanek biologicznych-Produkty pochodne i komórki eukariotyczne-Produkty ekspresjonowane	2005
Wytyczne dotyczące-produktu	Wytyczne techniczne dotyczące badań farmaceutycznych i oceny wniosków o badania kliniczne dotyczące rekombinowanego wektora{{0}wirusa skojarzonego z rekombinowanym adenowirusem (rAAV)-Produkty do terapii genowej in vivo	2023
Wytyczne dotyczące-produktu	Wspólne wymagania techniczne dotyczące jakości farmaceutycznej rekombinowanego wektora adeno-powiązanego wirusa (rAAV)-Produkty terapii genowej opartej na in vivo do wniosków o pozwolenie na dopuszczenie do obrotu	2025
Innowacyjne wytyczne	Wytyczne techniczne dotyczące walidacji platformy procesów usuwania wirusa na potrzeby badań klinicznych zastosowań terapeutycznych rekombinowanych produktów białkowych (próba)a	2024

a: Niniejsze wytyczne stanowią pierwszy przypadek, w którym chiński organ regulacyjny określił systematyczne wymagania techniczne dotyczące walidacji platformy procesów usuwania wirusów i są zgodne z duchem ICH Q5A(R2).

FDA i EMA-Wymagania regulacyjne w USA i Europie

W styczniu 2024 r. FDA wydała formalne wytyczne branżowe w oparciu o ICH Q5A(R2). Ponadto rozdział Farmakopei Stanów Zjednoczonych (USP)<1050.1>zawiera dodatkowe wytyczne techniczne dotyczące projektowania, oceny i charakteryzacji procedur usuwania wirusów. FDA organizuje co dwa lata sympozjum dotyczące usuwania wirusów; sympozjum w 2023 r. poruszało-nowoczesne tematy, takie jak nowatorskie metody, produkcja ciągła, nowatorskie nośniki chromatograficzne i filtry adsorpcyjne. Do najważniejszych dokumentów zawierających wytyczne EMA należą CPMP/BWP/268/95 (Nota dotycząca wytycznych dotyczących badań walidacyjnych wirusów: projekt, wkład i interpretacja badań potwierdzających inaktywację i usuwanie wirusów) oraz EMEA/CHMP/BWP/398498/2005 (Wytyczne dotyczące oceny bezpieczeństwa wirusów w badaniach biotechnologicznych produktów leczniczych), oba zharmonizowany z ICH Q5A(R2).

Identyfikacja źródeł skażenia wirusowego

ICH Q5A(R2) podkreśla, że ​​projekt walidacji eliminacji wirusa powinien opierać się na kompleksowej ocenie ryzyka. W przypadku produktów terapii genowej identyfikacja źródeł skażenia wirusowego powinna obejmować następujące poziomy:

Poziom banku komórkowego: Wirusy endogenne (np. cząstki retrowirusowe) i wirusy latentnie zakaźne, potencjalnie obecne w substratach komórek produkcyjnych (np. HEK293, CHO, HeLa). Wiadomo, że komórki HEK293 zawierają endogenne sekwencje Ad5 E1 i fragment EBV o długości około 900 bp i są zdolne do ekspresji-kompetentnego pod względem replikacji adenowirusa; dlatego też w ocenie ryzyka należy zwrócić szczególną uwagę na to ryzyko.

Poziom wirusa pomocniczego: do produkcji wektorów AAV zazwyczaj stosuje się metody takie jak potrójna transfekcja przy użyciu plazmidów pomocniczych, które niosą ze sobą ryzyko wytworzenia-kompetentnego pod względem replikacji adenowirusa (RCA). Podobnie komórki pakujące stosowane w produkcji wektorów lentiwirusowych mogą generować lentiwirusa-kompetentnego pod względem replikacji (RCL).

Poziom surowców: Przypadkowe wirusy mogą zostać wprowadzone poprzez surowce użyte w produkcji, w tym pożywki do hodowli komórkowych, pasze i enzymy. Ryzyko to jest szczególnie istotne w przypadku stosowania składników pochodzenia-zwierzęcego (np. płodowej surowicy bydlęcej, roztworów trawionych trypsyną).

Różnice ryzyka: terapia genowa a tradycyjne białka rekombinowane

Wymiar ryzyka	Tradycyjne rekombinowane produkty białkowe	Produkty terapii genowej
Źródło wirusowe	Endogenne wirusy z banku komórek; przypadkowe wirusy	Wirusy banków komórkowych; wirusy pomocnicze; wektory-kompetentne do replikacji (RCV/RCL); integracja genomu gospodarza
Substrat komórkowy	CHO, NS0, Sp2/0 i inne dobrze-scharakteryzowane linie komórkowe	HEK293, HeLa, CHO itp.; niektóre linie komórkowe mają pochodzenie nowotworowe
Charakterystyka produktu	Lek-na bazie białka; dobrze-zdefiniowaną strukturę	wektor wirusowy; stwarza ryzyko dla bezpieczeństwa biologicznego
Strategia walidacji	Wieloetapowe-eliminowanie wirusów; nacisk na walidację etapów procesu	Wymagane wykrywanie RCV/RCL; walidacja i testowanie są niezbędne
Walidacja platformy	Ma zastosowanie do ustalonych procesów, takich jak S/D, niskie pH, nanofiltracja	Ograniczone zastosowanie ze względu na różnorodność typów wektorów

Tabela 1. Porównanie zagrożeń bezpieczeństwa wirusologicznego: produkty terapii genowej i tradycyjne produkty zawierające rekombinowane białka

Zasady ogólne

Wybór wirusa wskaźnikowego jest centralnym elementem projektowania protokołów walidacji usuwania wirusa. ICH Q5A(R2) wymaga, aby wybór wirusa wskaźnikowego opierał się na ocenie ryzyka i uwzględniał następujące czynniki:

Znaczenie wirusa dla substratu komórki produkcyjnej (odpowiedni wirus)

Właściwości fizykochemiczne wirusa (otoczkowy/bez-otoczki, DNA/RNA, zakres wielkości)

Odporność wirusa na zabiegi fizyczne/chemiczne

Wykrywalność i bezpieczeństwo biologiczne wirusa

W przypadku produktów terapii genowej przy wyborze wirusa wskaźnikowego należy dodatkowo uwzględnić: rolę samego wirusa wektorowego jako „odpowiedniego wirusa”; potencjalne ryzyko skażenia wirusem pomocniczym; oraz wymagania dotyczące wykrywania i sprawdzania poprawności-wirusów zdolnych do replikacji (RCV/RCL).

Zalecany panel wirusów wskaźnikowych

Wirus	Typ	Koperta	Genom	Rozmiar (nm)	Uzasadnienie wyboru / zastosowanie
MVM	Parwowirus	Nic	ssDNA	18–26	Model bez koperty-; najmniejszy rozmiar i najwyższa odporność; nadaje się do walidacji nanofiltracji (ogólnie nie dotyczy produktów wektorowych rAAV)
PPV	Parwowirus	Nic	ssDNA	18–26	Model bez koperty-; powszechnie stosowany wirus wskaźnikowy w produktach krwiopochodnych
Reo-3	Reowirus	Nic	dsRNA	60–80	Model bez koperty-; średni rozmiar; wysoka stabilność fizyczna
PRV	Herpeswirusy	Tak	dsDNA	150–200	Model kopertowy; duży rozmiar; szeroki zakres gospodarzy
X-MuLV	Retrowirus	Tak	ssRNA	80–110	Model retrowirusa z otoczką; odpowiednie dla substratów komórkowych pochodzących z CHO-
BVDV	Flaviviridae	Tak	ssRNA	40–60	Model kopertowy; stosowany do oceny metod inaktywacji chemicznej (surogat HCV)
VSV	Rhabdoviridae	Tak	ssRNA	70	Model kopertowy; szeroka tolerancja pH; nadaje się do sprawdzania inaktywacji przy niskim-pH

Tabela 2. Zalecany panel wirusów wskaźnikowych do sprawdzania eliminacji wirusa w produktach terapii genowej

Specjalne uwagi dotyczące produktów wektorowych AAV

W przypadku rekombinowanych produktów wektorowych AAV Wytyczne techniczne NMPA dotyczące badań farmaceutycznych i oceny zastosowań prób klinicznych dla produktów terapii genowej opartych na wektorze rAAV-opartych na in vivo wymagają zwrócenia uwagi na wykrywanie-kompetentnych pod względem replikacji AAV (rcAAV). rcAAV odnosi się do AAV zdolnego do autonomicznej replikacji, która zazwyczaj powstaje w wyniku rekombinacji homologicznej pomiędzy plazmidem pomocniczym a genomem produktu AAV. Wykrywanie rcAAV na ogół przeprowadza się za pomocą testów zakaźnych lub metod qPCR, przeprowadzanych oddzielnie dla substancji leczniczej i oczyszczonego produktu.

Warto zauważyć, że dalsze procesy oczyszczania produktów wektorowych AAV zazwyczaj obejmują trawienie nukleazą, chromatografię (AEX), nanofiltrację i chromatografię jonowymienną (CEX/IEX). W tradycyjnej walidacji usuwania wirusa te etapy procesu mogą powodować znaczne straty samego wektora AAV; dlatego podczas projektowania modelu-w celu zmniejszenia skali należy dokładnie rozważyć interakcję między wirusami wektorowymi i wirusami wskaźnikowymi. W przypadku niektórych etapów procesu (np. nanofiltracja), gdzie straty wektora AAV są znaczne, należy ocenić, czy uzasadnione są dostosowania procesu w oparciu o dane walidacyjne (np. dostosowanie wielkości porów membrany nanofiltracyjnej).

Zasady ogólne

Model-zmniejszania skali (SDM) jest podstawowym narzędziem do sprawdzania eliminacji wirusa; jego projekt musi dokładnie odzwierciedlać wydajność usuwania wirusów w procesie produkcyjnym. ICH Q5A(R2), sekcja 6.2.2, wyraźnie wymaga, aby model zmniejszany-zachowywał spójność z procesem produkcyjnym w zakresie kluczowych parametrów. W przypadku produktów terapii genowej przy projektowaniu SDM szczególnie ważne są następujące kwestie:

Reprezentatywność krytycznych parametrów procesu

Model-zmniejszający skalę powinien być spójny z procesem produkcyjnym pod względem następujących parametrów: warunki chromatograficzne (skład buforu, pH, przewodność); stosunek obciążenia (stosunek masy białka wektor/supernatant); czas i temperatura kontaktu; natężenie przepływu/czas przebywania; czystość i skład produktu. W przypadku produktów AAV należy również szczegółowo uwzględnić wpływ rozkładu wielkości cząstek wektorów i zawartości pustych kapsydów na skuteczność nanofiltracji.

Wymagania dotyczące kwalifikacji modelu

ICH Q5A(R2) wymaga odpowiedniej kwalifikacji modelu-zmniejszania skali, w tym: porównania atrybutów jakości produktu (np. czystości, odzysku, gęstości); kwalifikacja spójności krytycznych parametrów procesu; oraz zapewnienie, że model-zmniejszania skali uwzględnia zmienność procesu produkcyjnego. W przypadku etapów chromatografii należy określić konsystencję profilu piku, elucji i przemywania; w przypadku etapów nanofiltracji należy sprawdzić wpływ pojemności objętościowej i składu produktu.

Wzór obliczeniowy LRV

Wartość redukcji log (LRV) jest podstawową miarą pomiaru skuteczności usuwania wirusa. ICH Q5A(R2), sekcja 6.5, zawiera szczegółowy opis metod obliczania LRV i traktowania statystycznego. Podstawowy wzór na obliczenie LRV jest następujący: LRV=log₁₀(N₀/N), gdzie N₀ to początkowe miano wirusa po skoku wirusa, a N to miano wirusa resztkowego po obróbce procesowej. Gdy miano resztkowego wirusa spadnie poniżej granicy wykrywalności testu, należy zastosować metody szacowania, takie jak rozkład Poissona (np. badanie-na dużą skalę).

Zastosowanie przedziałów ufności

Zarówno ICH Q5A(R2), jak i EMA CPMP/BWP/268/95 wymagają oceny przedziału ufności wyników obliczeń LRV. Zwykle stosuje się 95% przedział ufności.

Kryteria efektywności

Zgodnie z wytycznymi technicznymi NMPA dotyczącymi usuwania/inaktywacji wirusów z produktów krwiopochodnych, redukcja wirusa o wartość większą lub równą 4 log wskazuje, że etap procesu jest skuteczny w usuwaniu/inaktywacji wirusów. Jednakże kryterium to nie jest wartością progową bezwzględną i powinno być oceniane w sposób całościowy, łącznie z krzywymi kinetyki inaktywacji, uzasadnieniem naukowym wyboru wirusa wskaźnikowego i ogólną prawidłowością projektu protokołu walidacji. W przypadku produktów terapii genowej należy zwrócić szczególną uwagę na skumulowaną zdolność usuwania na wszystkich etapach procesu, aby zapewnić ogólny profil bezpieczeństwa wirusa na akceptowalnym poziomie.

Zastosowanie i wyzwania nanofiltracji

Filtracja-zatrzymująca wirusy (nanofiltracja) to krytyczny etap usuwania wirusów w dalszym oczyszczaniu produktów terapii genowej. Typowe filtry-zatrzymujące wirusy mają wielkość porów około 20 nm. Mechanizm usuwania wirusów w nanofiltracji polega przede wszystkim na wykluczaniu-na podstawie rozmiaru i może skutecznie usuwać większość wirusów większych niż rozmiar porów błony, w tym-małe parwowirusy bez otoczki, takie jak MVM i PPV.

Jednakże nanofiltracja produktów terapii genowej wiąże się z wyjątkowymi wyzwaniami: wielkość wektorów AAV (około 20–26 nm) jest podobna do wielkości niektórych wirusów wskaźnikowych (np. MVM, 18–26 nm), co może skutkować zmniejszonym odzyskiem wektorów; puste kapsydy mogą wpływać na strumień filtracji i skuteczność zatrzymywania wirusa; lepkość próbki może znacznie wzrosnąć wraz ze stężeniem wektora. Dlatego projekt SDM do walidacji nanofiltracji powinien w pełni uwzględniać wpływ rozkładu wielkości cząstek wektorowych i zawartości pustych kapsydów na skuteczność filtracji, a także należy rozważyć zastosowanie membran nanofiltracyjnych o większych rozmiarach porów, jeśli jest to właściwe.

Ocena usuwania wirusa w etapach chromatografii

Chromatografia jonowymienna (IEX) jest podstawowym etapem procesów oczyszczania produktów AAV i zazwyczaj wykorzystuje trawienie nukleazą, a następnie chromatografię anionowymienną (AEX) w celu wychwycenia pustych i wadliwych kapsydów lub chromatografię kationowymienną (CEX) w celu dokładnego oczyszczenia pełnych kapsydów. Mechanizmy usuwania wirusa na etapach chromatografii obejmują wykluczanie wielkości, oddziaływania elektrostatyczne, oddziaływania powinowactwa i inne czynniki. Dyskusje podczas sympozjum dotyczącego usuwania wirusów FDA 2023 podkreśliły, że na skuteczność usuwania wirusów na etapach chromatografii wpływa wiele czynników, w tym ładowność, pH, przewodność i obieg żywicy; Do kompleksowej oceny należy zastosować wieloczynnikowe-podejście do projektowania ortogonalnego.

Wirusowa kontrola bezpieczeństwa w produkcji ciągłej

Nowo dodany rozdział 7 ICH Q5A(R2) określa szczegółowe wymagania dotyczące oceny bezpieczeństwa wirusowego w produkcji ciągłej. W przypadku produktów terapii genowej produkcja ciągła stała się ważnym kierunkiem rozwoju, ale wprowadza też nowe wyzwania w zakresie bezpieczeństwa wirusowego. Strategie kontroli bezpieczeństwa wirusowego w produkcji ciągłej obejmują:-inline filtry barierowe dla wirusów jako krytyczne środki zabezpieczające; odpowiedni projekt czasów przebywania i przepływów procesów; włączenie etapów inaktywacji z określonymi czasami przetrzymania; oraz ulepszone zastosowanie technologii analizy procesu (PAT) do monitorowania-krytycznych parametrów procesu w czasie rzeczywistym.